空气过滤是最有效、安全、经济和方便的除菌手段。采用合适的过滤器能保证洁净手术室以合理的运行费用达到所要求的尘埃浓度和细菌浓度。通常整个洁净手术室净化空调系统设有三级空气过滤。第一级空气过滤宜设置在新风口，第二级设置在系统的正压段，第三级宜设置在系统的末端。如采用独立新风系统，也要求设置三级过滤，末级过滤至少为亚高效空气过滤器。

末端空气过滤器的良好性能是室内无菌环境的保证，而过滤系统的合理配置可延长末端空气过滤器的使用寿命，使三级过滤系统阻力增长平稳。尽管早在80年代已经证实比色法效率90%～95%的过滤器（相当于我国的高中效至亚高效过滤器）能滤掉医院中全部细菌的99.9%，但是各国最新修订的医院通风标准普遍有提高过滤效率的趋势。《标准》强调I级、II级、III级洁净手术室必须设置高效空气过滤器。只有在IV级洁净手术室才容许设置亚高效空气过滤器。考虑到洁净手术室是一个保障体系，静电净化器不宜设置在送风末端。

三级过滤的概念是一个完整的概念，合理地配置过滤系统是最有效的措施。要想发挥出系统的整体效能，每一级过滤器选择和位置设置都不容忽视，如果疏忽了某一个环节，或某一级过滤器设置不匹配，会使三级过滤器的更换期不合理，造成整体的过滤效能欠佳等问题。我国在高中效范围内的滤料和过滤器品种很少，设置在空调箱内的中效过滤器的过滤性能大多偏低，不能有效地保护末端高效过滤器，影响其使用寿命。尽管洁净手术室用的末端过滤器主要性能是效率，但它的其他性能也会影响到室内环境的无菌程度，也需慎重选择。正常情况下过滤器不会滋菌，为了杜绝细菌滋生的可能性，过滤器所用材料应是憎水性，且不能选用有机材料，如框架为胶合板或木板的过滤器；如末端过滤装置采用有隔板过滤器，应排除分隔板是牛皮纸或铜版纸的产品，采用铝隔板较好；如末端过滤装置采用无隔板过滤器，不宜用直接以棉线作为分隔物的产品。另外过滤装置的使用周期不宜过长。

在回风口处应注意设置过滤器，如室内压力允许，在回风口处设中效过滤器。由于洁净手术室内人员操作以及术前、术后的清理工作，回风中可能含有较多的毛发和纺织纤维等，这些纤维通过回风管路，特别容易沉积在管路上，引起积尘滋菌；或者沉积在盘管上，影响传热效率，甚至发生堵塞，降低风量。回风口设置过滤器也可较为容易地建立起正压。